ročník 2007/2008:

Vydavatel: MEDON s.r.o.

Havelská ul. 14,
 Praha 1
222 094 300
medon@sendme.cz
http://www.medon.cz


Hledat výraz:

 
tisk článku  

::  Nedoceněné proteázy  ::


PharmDr. Josef Bakeš, Ph.D.
Ústavní lékárna, Podřipská nemocnice s poliklinikou Roudnice nad Labem s. r. o.
MVDr. Josef Illek
Klinika přežvýkavců, Fakulta všeobecné veterinární medicíny, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Souhrn

Enzymoterapie jako nástroj nespecifické protizánětlivé terapie utrpěla na začátku tohoto tisíciletí velké rozčarování a i mnohé zklamání. Bylo to způsobeno až zkomercializovaným podáváním směsi polyfunkčních enzymů (Wobenzym), která nemá čistě specifický účinek. Naopak podávání samotných proteáz jen s rutosidem (Phlogenzym), mimo akutní záněty, nestandardně podávaných v dalších indikacích (topické podání u hydrokély novorozence a poporodních mastitidách) má překvapivě dobrou klinickou odezvu. Je-li možno připravit a podat topickou formou enzymy s proteolytickou aktivitou a s jakým efektem bylo cílem pokusu s účastí 11 dojnic v laktaci s klinicky manifestovaným zánětem minimálně jedné čtvrti vemene. Dojnice byly rozděleny do dvou skupin. Skupině A bylo podáváno topicky ve formě masti samostatné antibiotikum (celkem 6 dávek). Skupině B byla stejnou metodou aplikována terapeuticky podprahová dávka téhož antibiotika (celkem 5 dávek) a směs enzymů v jedné lékové formě. Oproti skupině A tak byla snížena jak dávka, tak celkový počet aplikací. Před zahájením a po ukončení terapie byly odebrány vzorky mléka k mikrobiologickému vyšetření a vzorky krve ke stanovení fibrinogenu a ceruloplasminu jako proteinů akutní fáze. V mléce obou skupin dojnic byly před započetím terapie prokázány běžné mastopatogeny, po léčbě byl bakteriologický nález negativní. Průměrná plazmatická koncentrace fibrinogenu u skupiny A signifikantně stoupla z 6 ± 1.4 na 7.4 ± 1.1 g/l, u skupiny B nevýznamně poklesla z 6.5 ± 0.86 g/l na 6.4 ± 0.9 g/l, rozdíl mezi skupinami byl významný (p < 0,05). Průměrná plazmatická koncentrace ceruloplazminu stoupla u skupiny A statisticky signifikantně z 0.9 ± 0.2 na 1.3 ± 0.18 µmol/l a u skupiny B nesignifikantně z 0.9 ± 0.36 na 1.1 ± 0.26 µmol/l, rozdíl mezi skupinami nebyl významný. Prokázali jsme pozitivní vliv opakované lokální aplikace směsi proteolytických enzymů. Enzymoterapie snížila terapeutické dávky antibiotika a potlačila vzestup sledovaných indikátorů zánětu.

Klíčová slova: mastitis, bromelain, papain, trypsin

Úvod

Výskyt mastitid u kojících žen je dodnes ne příliš častou, ale za to velmi akutní zánětlivou reakcí, kde je nezbytné včas nasadit systémová antibiotika. Kojenec vlivem výskytu zánětlivé tekutiny až nepodobné mléku přechází na umělou výživu. Dá se říci, že dochází jednou příčinou k významnému problému u dvou lidí. Daleko častěji a v závislosti na původci v různé intenzitě vykazuje onemocnění akutní mastitidou mléčná žláza krav v období laktace.  Veterinární medicína je v terapii této diagnózy proto více zkušená, než medicína humánní.   Pro zajištění co nejkratší a nejúčinnější léčby akutních mastitid je nutné podpořit kauzální terapii zaměřenou na původce (antiinfektiva) terapií symptomatickou potlačující zánět (antiflogistika). V praxi se terapeuticky uplatnily glukokortikoidy, méně nesteroidní antiflogistika (NAF) a enzymy. Mnohé studie prokázaly srovnatelnost účinku enzymů a NAF (Salamberidze et al. 2002). Systémový vliv je i s přihlédnutím k nežádoucím účinkům nejvýznamnější u glukokortikoidů. Narozdíl od enzymů je u glukokortikoidů  protizánětlivý účinek provázen nežádoucí imunosupresí.
 
K pozitivně adjuvantním vlivům enzymoterapie patří potenciace účinku antibiotik v místě zánětu, zvyšování intenzity akutní buněčné odpovědi a protiedémový účinek trypsinu, chymotrypsinu a bromelainu a edém-protektivní účinek papainu (Kasseroller a Wenning 2003). Dávky antibiotik v kombinaci s enzymoterapií mohou být sníženy až na polovinu dávek monoterapeutických (Suchich et al.1997), současně se zrychluje ústup klinických symptomů nemoci (Tinozzi a Venegoni 1978, Luerti a Vignali 1978, Neubauer 1961). Proteázy mění spektrum adhesivních molekul v buněčné membráně (Wald et al. 2001), což příznivě ovlivňuje produkci různých typů cytokinů. Proteázy zvyšují clearence prozánětlivých cytokinů (Desser et al. 1999, Desser et al. 2001, Xiang et al. 2001), dále zvyšují koncentraci plasminogenu v krvi, snižují tvorbu fibrinu a rozpouštějí již vzniklé tromby. Snížení agregace trombocytů pomáhá udržet průchodnost mikrocirkulace (Nouza et al. 1999).
 
Cílem naší práce bylo ověřit prospěšnost lokálního podání proteolytických enzymů jako symptomatické léčby mastitid při současném snížení celkové dávky antibiotika. Pro hodnocení jsme zvolili vývoj dynamiky ceruloplasminu, fibrinogenu a výsledky mikrobiologického vyšetření odebraných vzorků.
 

Metodika

Experimentální část byla provedena v chovu společnosti AGRO MONET a.s. Moutnice, farma Těšany u Brna. Do studie bylo zařazeno 11 dojnic v laktaci splňující stanovená kritéria: klinicky manifestovaný zánět minimálně jedné čtvrti vemene, stáří 4 - 12 let, objemově patrné a neplánované snížení kvantity produkce mléka, pozitivní stájový test, změny v kvalitě mléka. Od okamžiku zařazení do studie byla každá dojnice přemístěna do karantény. Oddojené mléko bylo likvidováno až do skončení ochranné lhůty použitého léčiva. Dojnice byly roztříděny do dvou skupin. S využitím poznatků o absorpci a penetraci některých solí ß-laktamových antibiotik podaných do struku byla obou skupinám dojnic podávána stejná sůl širokospektrého cefalosporinu III. generace připravená ve sterilním lipofilním masťovém základu. Skupině A byla mast obsahující 2,5x více antibiotika aplikována dvakrát denně po 3 dny intramamálně jen do zánětem postižených čtvrtí. Dojnicím ve skupině B byla aplikována kombinace téhož antibiotika v dávce terapeuticky podprahové a směs enzymů v jedné lékové formě. Směs enzymů byla připravena ze 3 dražé galenicky modifikovaného registrovaného enzymového přípravku Wobenzym drg. (Mucos, SRN). Poměr proteolytické aktivity: 46.15 % papain,18.46 % trypsin, 0.77 % chymotrypsin a 34.61 % bromelain. Přípravek byl aplikován jen do zánětem postižených čtvrtí v aplikačním schématu: první a druhý den 2x denně jedna dávka, 3. den jen jedna dávka. Oproti skupině A tak byla snížena jak dávka, tak počet aplikací. V obou skupinách byla léčiva aplikována ve formě intramamální sterilní masti o objemu 10 cm3 v jednorázovém sterilním injektoru tak, že konická špička aplikátoru injektoru byla opatrně vsunuta přes strukový otvůrek do struku postižené čtvrti a stlačením injektoru byl jeho celý objem do ní vytlačen vždy po vydojení a desinfekci hrotu struku. Přípravek byl uchováván v chladničce při teplotě 2 – 8 °C na 15 min před aplikací byl z chladničky vyjmut. Před započetím terapie a 12 – 24 hod po jejím skončení byly odebrány vzorky mléka a krve. Mléko bylo odebráno odstřikem středního toku ze struku všech produktivních čtvrtí do skleněných sterilních zkumavek a mikrobiologicky vyšetřeno v mikrobiologické laboratoři SVÚ Brno na přítomnost (Str. agalactiae, Str.dysgalactiae, Str. uberis, Staph. aureus, E. coli a Klebsiella). Vzorky krve byly odebrány punkcí z ocasní žíly do plastových vakuovaných sterilních zkumavek pro stanovení fibrinogenu a ceruloplasminu jako proteinů akutní fáze.

Fibrinogen byl stanovován turbidimetrickým stanovením pomocí setu FIBRINOGEN Boehringer Mannheim, v OKB FN Brno. Stanovení ceruloplasminu v krevním séru (Henry et al. 1974) bylo provedeno na biochemickém analyzátoru COBAS MIRA S, v laboratoři klinické biochemie Kliniky chorob přežvýkavců FVL VFU Brno. Pro statistické hodnocení hladiny obou proteinů akutní fáze bylo užito F testu a párového a nepárového t-testu. Rozdíl byl považován za statisticky významný při p < 0,05.

Výsledky

U dojnic skupiny A bylo zánětem postiženo celkově 18 čtvrtí vemene, průměrná celková dávka na jednu čtvrť byla minimálně 1400 mg antibiotika. U dojnic skupiny B bylo celkově postiženo 18 čtvrtí vemene, průměrné celkové dávky na jednu čtvrť byly 500 mg antibiotika a 1870 mg celkového enzymu. Výsledky mikrobiologického vyšetření jsou uvedeny v tab. č. 1. Zatímco před léčbou byly ve vzorcích mléka u všech sledovaných dojnic prokázány respektive patogenní zárodky s převážným zastoupením Str. agalactiae (7x) , bakteriologické vyšetření vzorků získaných 24 hodin po léčbě přineslo negativní nálezy (tab.č.1).
 
Průměrná hodnota plazmatické koncentrace fibrinogenu ve skupině A byla před terapií 6 ± 1.4 g/l, po terapii 7.4 ± 1.1 g/l. Ve skupině B vstupní průměrná hodnota parametru 6.5 ± 0.86 g/l, výstupní 6.4 ± 0.9 g/l. Hladiny fibrinogenu hodnocené párovým t-testem (tab.č.2a) vzájemně mezi vstupním a výstupním dnem v rámci skupiny dosáhly statistického významu u dojnic ve skupině A, kdy došlo 4. den studie k navýšení parametru v průměru o 27 % oproti vstupním hodnotám. Rozdíly u dojnic ve skupině B nebyly statisticky významné, ačkoli u většiny dojnic byl patrný pokles oproti vstupním hodnotám. V porovnání procentuální změny sledovaného parametru vzájemně mezi skupinami (tab.č.2b) došlo u skupiny B k velmi významnému poklesu hodnoceného parametru oproti skupině A.
 
Průměrná hodnota ceruloplasminu byla ve skupině A před terapií 0.9 ± 0.2 µmol/l, po terapii1.3 ± 0.18 µmol/l. Ve skupině B vstupní průměrná hodnota parametru byla 0.9 ± 0.36 µmol/l, výstupní 1.1 ± 0.26 µmol/l. Hodnoty parametru ceruloplasminu hodnocené párovým t-testem (tab.č.3a) vzájemně mezi vstupním a výstupním dnem v rámci skupiny, doznaly velkého statistického významu jen u skupiny A, kdy došlo k navýšení parametru v průměru o 49 % oproti vstupním hodnotám. Změny ve skupině B nebyly statisticky významné, ačkoli u všech dojnic byl patrný nárůst oproti vstupním hodnotám. V porovnání procentuální změny sledovaného parametru vzájemně mezi skupinami (tab.č.3b) nebyl shledán statistický význam.
 

Diskuse

V terénním pokusu s podpůrným léčebným použitím enzymů při terapii mastitid jsme prokázali pozitivní vliv opakované lokální aplikace směsi převážně proteolytických enzymů. Enzymoterapie jednak vedla ke snížení terapeutické dávky antibiotika, jednak potlačila vzestup ceruloplasminu a fibrinogenu jako indikátorů zánětu, což svědčí i pro její systémový účinek při lokálním působení. Předpoklad prospěšnosti v nasazení kombinace vycházel z dříve publikovaných studií, kdy proteolytické enzymy (bromelain) dokázaly zvýšit koncentraci antibiotika v místě zásahu (Luerti a Vignali 1978, Tinozzi a Venegoni 1978, Neubauer 1961). Mechanismus účinku není objasněn, spekuluje se o teorii aktivace proteázami aktivovaných receptorů (Olejar a Nouza 1998). Některé studie založené na průkazu cytotoxické aktivity proteáz  in vitro prokázaly, že jejich přítomnost již po 10 minutách vyvolala sedminásobné zvýšení aktivity makrofágů a třináctinásobné zvýšení aktivity přirozených zabíječů (NK buněk) (Desser et al. 1993). Domníváme se, že touto cestou by snad mohla být ovlivněna vyšší koncentrace antibiotika v místě zásahu, tj. vlivem zvýšené aktivity makrofágů, které fagocytují některá antibiotika a inkorporují je do místa zánětu. Jednou z dalších možností ovlivnění dostupnosti antibiotik v přítomnosti proteolytických enzymů může být i vliv enzymů na fyzikálně chemické vlastnosti plazmatických proteinů, na které se mnohá antibiotika vážou a za normálních okolností se tak stávají méně dostupnějšími pro působení. S nižší dávkou antibiotika je rovněž spojeno snížení nákladů na léčbu, zkrácená ochranná lhůta mléka a tak ekonomická úspora.
 
Pro hodnocení intenzity zánětu byla v krvi sledována dynamika ceruloplasminu a fibrinogenu, jako využívaných proteinů akutní fáze, jejichž stanovení se také využívá jako markerů zánětu u mastitid (Kováč et al. 2005).
 
Fibrinogen je koagulační faktor I, protein akutní fáze, který je při zánětu rychleji produkován než odbouráván. Jeho další významnou funkcí je tvorba fibrinové matrix, která umožňuje pohyb fibroblastů a jiných buněk a stimuluje jejich produkci při hojení poškozené tkáně ad secundam. Jeho biologický poločas je 2.4 – 4.2 dny (Masopust 1998). Na rozdíl od statisticky významného vzestupu fibrinogenu u skupiny A byl u skupiny B (s enzymoterapií) zjištěn jeho pokles, byť nesignifikantní. Lze jej zřejmě vysvětlit přímým nebo nepřímým antiinflamačním vlivem enzymoterapie. Tato interpretace je v souladu s dříve publikovanými výsledky (Kasseroller a Wenning 2003 a Guggenbichler 1988), které přisuzují enzymoterapii antiedematózní, fibrinolytický, antiagregační a tím i analgický účinek na tkáň postiženou zánětlivým procesem. Nelze vyloučit, že inhibice vzestupu fibrinogenu může být ovlivněna přímou fibrinolytickou schopností některých proteolytických enzymů (Nouza et al. 1999).
Ceruloplasmin rovněž patří mezi markery zánětu, při zánětu je vyšší tvorba než odbourávání. Poločas ceruloplasminu je 2–3 dny (Masopust 1998). Proto  se jeho pokles i v případě protizánětlivého účinku podaného léčiva zpožďuje. U dojnic ve skupině A došlo ke statisticky významnému nárůstu oproti vstupním hodnotám, u skupiny B význam zjištěn nebyl. Přesto u obou skupin po ukončení léčby vzrostly výstupní hodnoty: u skupiny A o 42 % a u skupiny B o 23 % oproti vstupním hodnotám. Domníváme se, že v případě skupiny A, byl léčivem učiněn přímý zásah na infekční agens bez jeho schopnosti přímo ovlivnit projevy zánětu, které za normálních okolností klesají postupně, až při hojení zánětu. Do okamžiku zvratu nad procesem poškození a reparace dochází k omezenému setrvačnému vzrůstu hodnot markeru. U skupiny B, byl tento proces setrvačného vzrůstu zřejmě nepřímo zbrzděn antiinflamačním účinkem enzymoterapie. Statisticky významné ovlivnění hladiny sledovaných proteinů akutní fáze dále svědčí o systémovém vlivu intramamálně aplikované směsi proteolytických enzymů.
 
Závěrem můžeme shrnout, že topicky aplikované makromolekulární látky charakteru proteolytických enzymů mají systémový vliv a že kombinace enzymů s antibiotiky může dosáhnout snížení dávky antibiotik s dosažením stejného efektu jako při léčbě antibiotiky podávanými v monoterapii v terapeutické dávce, a současně se podílí na snížení intenzity zánětu.
 
Hydrokéla je způsobena  nahromaděním tekutiny uvnitř tunica  vaginalis  testis.  Může  se   nalézat  v  oblasti  semenného provazce  (funiculocele),  ale  častěji  se  vyskytuje  kolem varlete.  Může  se  vyskytovat  i  u  žen  (hydrocele canalis Nuckii).  Rychlý  vznik  hydrokély  může  nastat  po poranění šourku,  po akutní  nespecifické i  specifické (TBC)  infekci orgánů  šourku,  nebo  po  radioterapii. Komunikující hydrokéla v dětství je způsobena  průchodností  peritoneálního  processus vaginalis testis. Může být spojena s  nepřímou tříselnou kýlou. Většina komunikujících  hydrokél v  dětství se  spontánně uzavře před dosažením 1.  roku věku. Pokud  přetrvává, je třeba  operační korekce stejně tak, jde-li současně o kýlu s obsahem střevní kličky. Hydrokéla  většinou není  bolestivá, není-li přítomen zánět. Léčba hydrokély u chlapců starších jednoho roku je pouze chirurgická a spočívá v revizi  varlete  z  inguinálního přístupu,  kdy je revidován  stav  spermatického  provazce,  processus vaginalis     peritonei a canalis inguinalis  a provedena operační korekce. Vyzkoušeli jsme v praxi pediatrické ambulance, že podáním 10% enzymové masti, připravené magistraliter z jader dražé přípravku Phlogenzym, nastala klinická odezva u dvouměsíčního chlapce s hydrokélou do čtyř dnů. Do deseti dnů došlo k vyhojení ad integrum. Slibné výsledky se jeví u matek s mastitidou, kterým byla podána ke zmírnění projevů zánětu v oblasti prsu mast o stejném složení, jako v předchozím případě. Pacientkám byla současně podávána systémová antibiotika. 

Proteázy mají neodiskutovatelné místo v terapii otoků. Současně lze konstatovat, že podávání antimikrobiálně účinných látek spolu s vybranými proteázami: bromelain, chymotrypsin,…), by mělo být v budoucnu předmětem hlubšího hodnocení, které nám může napomoci řešit širokou problematiku hledání vhodné terapie infekčních zánětů a s ní spojených rizik.
 

Literatura
Desser, L, Herbacek, I, Zavadova, E, Mohr ,T 1999: Polyenzyme preparations interrupt the autocrine loop of TGF-beta production in melanoma cells by conversing alpha2Macroglobulin (a2M) into the fast-form which binds TGF-beta irreversible. European Journal of Cancer 35: 375-376.
Desser, L, Holomanova, D, Zavadova, E, Pavelka, K, Mohr, T, Herbacek, I 2001: Oral therapy with proteolytic enzymes decreases excessive TGF-beta levels in human blood. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, pp.125-131
Desser, L, Rehberger, A, Kokron, E, Paukovits, W 1993: Cytokine synthesis in human peripheral blood mononuclear cells after oral administration of polyenzyme preparations. Oncology 50:403-407
Henry, R, Cannon, D, Winkelman, J 1974: Clinical Chemistry, Principles and Technics. Harper & Row, New York, 398 p.
Kasseroller, R, Wenning, H 2003: Efficacy and tolerability of proteolytic enzymes as an anti-inflammatory agent in lymphoedema after axillary dissection due to mammary cancer. European Journal of Lymphology 10:18-26.
KOVAC, G, VARGOVA, M, POPELKOVA, M, NOVOTNY, J 2005: Acute Phase Proteins in Cattle. Achievements and Prospects of Ruminants Medicine. Pulawy, 48-53.
Luerti, M, Vignali, M 1978: Influence of Bromelain on Penetration of Antibiotics in Uterus, Salpinx and Ovary. Drugs Exp Clin Res 4:45-48.
Masopust, J 1998: Klinicka biochemie: požadování a hodnocení biochemických vyšetření II. část. Karolinum, Praha, 345 p.
Neubauer, R 1961: A plant protease for potentiation of and possible replacement of antibiotics. Exp Med Surg 19:143-160.
Nouza, K, Olejar, T, Nouza, M 1999: Proteázy v regulaci a modulaci imunity. Klinická imunologia 3:27-28
Olejar, T, Nouza, K 1998: Trombin a trypsin regulují buněčnou odpověď aktivací specifických receptorů. Zpravodaj klinické farmakologie a farmacie 4:19-22.
Salamberidze, L, Kartvelishvili, E, Lortkipanidze, M 2002: Effect of current administration of Taureodon and Wobenzym in Rheumatoid Arthritis. International Journal on Immunorehabilitation 1:110-111
Suchich, G, Loginova, N, Faizullin, L, Zdanov, A, Malinina, E, Bozedomov, V 1997: The use of Wobenzym to facilitate interferon synthesis in the treatment of chronic urogenital chlamydiosis. International Journal on Immunotherapy 13:131-133.
Tinozzi, S, Venegoni, A 1978: Effect of bromelain on serum and tissue levels of amoxicillin. Drugs Exp Clin Res 4:39-44.
Wald, M, Olejar, T, Sebkova, V, Zadinova, M, Boubelik, M, Pouckova, P 2001: Mixture of trypsin, chymotrypsin and papain reduces formation of metastases and extends survival time of C57Bl6 mice with syngeneic melanoma B16. Cancer Chemother Pharmacol 47 Suppl: S16-S22.
Xiang, G, Schinzel, R, Simm, A, Munch, G, Sebekova, K, Kasper, M, Niwa, T, Schmitz, C, Heidland, A 2001: Advanced glycation end products (AGEs)-induced expression of TGF-beta 1 is suppressed by a protease in the tubule cell line LLC-PK1. Nephrol Dial Transplant 16:1562-1569.